分子診斷中PCR和mNGS在傳染病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用
分子診斷技術(shù)主要分為PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、核酸質(zhì)譜及基因測(cè)序。而在傳染病檢測(cè)領(lǐng)域，PCR技術(shù)和基因測(cè)序應(yīng)用更加廣泛。
1）PCR技術(shù)檢測(cè)速度快，市場(chǎng)份額大。在傳染病的診斷和血篩方面，基于PCR技術(shù)的分子診斷能縮短診斷的窗口期，并且可以定量對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)。相比于傳統(tǒng)的免疫診斷方式而言，有不可替代的優(yōu)勢(shì)。所以，基于PCR的分子診斷往往是醫(yī)院對(duì)傳染病診斷的最后“金標(biāo)準(zhǔn)”也是應(yīng)用最廣泛的分子診斷技術(shù)，占據(jù)最大的市場(chǎng)份額。
2）NGS通量大，效率高，正在高速發(fā)展并不斷占據(jù)市場(chǎng)份額?；驕y(cè)序目前已進(jìn)入二代測(cè)序（NGS）時(shí)代。NGS擁有高通量、無(wú)需培養(yǎng)、高敏感度、能夠鑒定未知病原體及罕見(jiàn)病原菌等優(yōu)勢(shì)，在傳染病的預(yù)防和控制中發(fā)揮著重要作用。
PCR診斷
1、現(xiàn)狀
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，利用DNA在體外攝氏95°C高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5′-3′)的方向合成互補(bǔ)鏈。PCR診斷就是基于PCR技術(shù)完成病原體基因片段的擴(kuò)增，從而確定樣本中病原體的存在，實(shí)現(xiàn)患者的確診。
PCR技術(shù)易操作，臨床應(yīng)用程度高。從PCR技術(shù)發(fā)明至今已過(guò)30年，而PCR技術(shù)也發(fā)展到第三代。PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)傳染性疾病的診斷，既可以選擇病原體基因中的保守區(qū)做通用檢測(cè)，也可以選定差異較大的基因部分做分型檢測(cè)，而且檢測(cè)的靈敏度和特異性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)當(dāng)前的免疫學(xué)檢測(cè)方法，所需時(shí)間也可達(dá)到臨床要求，尤其適用于難以培養(yǎng)的病毒、細(xì)菌和原蟲(chóng)等。目前主要運(yùn)用的是第二代和第三代PCR技術(shù)。1）第二代PCR。第二代PCR就是熒光定量PCR技術(shù)（Real-Time PCR），也叫做qPCR。熒光定量PCR通過(guò)在反應(yīng)體系中加入能夠指示反映進(jìn)程的熒光探針，通過(guò)熒光信號(hào)的積累來(lái)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的積累。目前常用于傳染性疾病病原體檢測(cè)、疾病耐藥基因研究等方面。該技術(shù)操作流程更簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)高效，需要的DNA和RNA加樣量少，不過(guò)也存在易污染的問(wèn)題，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。如本次疫情中研發(fā)的試劑盒就有部分使用了PCR技術(shù)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，也有部分試劑盒出現(xiàn)了假陽(yáng)性的反應(yīng)。2）第三代PCR。第三代PCR技術(shù)叫做數(shù)字PCR（Digital PCR, dPCR, Dig-PCR），這是目前全新的一種PCR檢測(cè)方式，能對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)和定量，采用直接計(jì)數(shù)目標(biāo)分子而不依賴(lài)任何校準(zhǔn)物或者外表，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目。相較于二代技術(shù)，數(shù)字PCR靈敏度更高，定量更準(zhǔn)確，抗干擾能力更強(qiáng)，但是對(duì)模板質(zhì)量和引物特異性要求較高。目前數(shù)字PCR技術(shù)可用于檢測(cè)病毒感染和細(xì)菌、HIV病毒潛伏庫(kù)監(jiān)測(cè)、殘留病毒載量等。
2、市場(chǎng)規(guī)模
感染性疾病領(lǐng)域臨床需求穩(wěn)定，PCR診斷規(guī)模達(dá)十億級(jí)別。根據(jù)火石創(chuàng)造的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，近年全球分子診斷行業(yè)年均增速約為11%，而我國(guó)分子診斷行業(yè)年均增速則達(dá)到了24%，為全球增速的兩倍。PCR作為分子診斷極其重要的組成部分，由于臨床需求推動(dòng)PCR診斷穩(wěn)步放量，預(yù)計(jì)2021年市場(chǎng)規(guī)模達(dá)53.4億元。根據(jù)測(cè)算，基于PCR平臺(tái)的感染性疾病發(fā)病人數(shù)有望從2017年555.30萬(wàn)人/年增加到2021年的577.84萬(wàn)人/年，應(yīng)用PCR平臺(tái)產(chǎn)生的診斷費(fèi)用有望由2017年的13.88億元增加到2021年的14.45億元。在血篩方面，根據(jù)衛(wèi)計(jì)委相關(guān)數(shù)據(jù)，全國(guó)無(wú)償獻(xiàn)血人次從1998年的5萬(wàn)人次增長(zhǎng)到 2013 年的1278萬(wàn)人次，增長(zhǎng)了近256倍。由于艾滋病、肝炎等傳染病主要通過(guò)血液傳播，受血者一旦輸入了感染了病毒的血液，被感染的概率接近100%，危害性極高，因此對(duì)血液安全檢測(cè)擁有強(qiáng)烈的剛性需求。我國(guó)開(kāi)始于2010年的血站系統(tǒng)核酸檢測(cè)（NAT）試點(diǎn)工作將在未來(lái)繼續(xù)推廣，根據(jù)我國(guó)的獻(xiàn)血人次，至少將帶來(lái)每年1200萬(wàn)人份左右用于血源篩查的核酸檢測(cè)試劑市場(chǎng)需求。基于PCR平臺(tái)的血篩市場(chǎng)規(guī)模有望由2017年的4.09億元增加到2021年的6.21億元。
3、競(jìng)爭(zhēng)格局
PCR儀器市場(chǎng)目前仍由國(guó)際廠商主導(dǎo)。在三級(jí)醫(yī)院高端PCR儀器市場(chǎng)中，國(guó)際廠商仍占據(jù)主流。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上約有PCR儀器廠商數(shù)十家，進(jìn)口品牌包括賽默飛、伯樂(lè)、羅氏等，國(guó)產(chǎn)廠商則包括西安天隆、杭州郞基、珠海黑馬、杭州博日、上海領(lǐng)成等，進(jìn)口品牌約占市場(chǎng)總量的70%以上。國(guó)外代表企業(yè)的PCR儀器價(jià)格每臺(tái)在3萬(wàn)元到9萬(wàn)元之間，國(guó)內(nèi)企業(yè)獲批的PCR儀器主要在技術(shù)水平要求相對(duì)較低的核酸提取/純化儀及PCR擴(kuò)增儀領(lǐng)域，價(jià)格則每臺(tái)在2.6到2.8萬(wàn)元之間，國(guó)產(chǎn)PCR儀器具有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，因此國(guó)產(chǎn)PCR儀器在二級(jí)及以下醫(yī)院布局具有很大優(yōu)勢(shì)。
PCR試劑基本實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化，國(guó)內(nèi)多家企業(yè)布局PCR產(chǎn)品。PCR試劑可分為核酸提取試劑及核酸診斷試劑，由于PCR檢測(cè)系統(tǒng)多為開(kāi)放式，試劑研發(fā)技術(shù)門(mén)檻較儀器低，國(guó)內(nèi)廠商憑借在價(jià)格及渠道方面的優(yōu)勢(shì)，PCR試劑已基本實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化。目前針對(duì)常見(jiàn)傳染病的檢測(cè)，如乙肝、丙肝、艾滋病等，多家國(guó)產(chǎn)企業(yè)研發(fā)了試劑盒，包括華大生物、之江生物、圣湘生物、邁克生物等企業(yè)，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠家數(shù)均遠(yuǎn)大于國(guó)外廠家。甲型、乙型、丙型流感等常見(jiàn)疾病的核酸檢測(cè)試劑盒也已經(jīng)比較成熟，競(jìng)爭(zhēng)廠家較多，幾乎全部為國(guó)產(chǎn)品牌。
mNGS
1、現(xiàn)狀
mNGS是感染性疾病診斷的重要技術(shù)。對(duì)于基因測(cè)序而言，其對(duì)于病原體的篩查，不僅限于傳染性疾病，而是在整個(gè)感染性疾病范圍（感染性疾病包括傳染病以及其他不具備傳染性的病原體感染性疾?。８腥绢?lèi)疾病的檢測(cè)重點(diǎn)在于檢出率、時(shí)效性、功能指標(biāo)分析和對(duì)于未知病原的快速定性分析能力，傳統(tǒng)檢測(cè)手段存在病原體培養(yǎng)周期長(zhǎng)、成功率低、功能指標(biāo)分析能力不足和難以做到廣譜檢測(cè)的缺點(diǎn)，而基因測(cè)序則為解決這些問(wèn)題提供了一個(gè)新的途徑。目前主流的基因測(cè)序技術(shù)是二代測(cè)序(Next-generation Sequencing ,NGS)，當(dāng)NGS技術(shù)用于感染性疾病檢測(cè)時(shí)，NGS會(huì)測(cè)出樣本中所有的微生物，而不是像PCR那樣只有單一靶標(biāo)，同時(shí)也無(wú)需提前獲悉待測(cè)病原體的序列信息，所以此時(shí)NGS也被稱(chēng)為mNGS（meta-genomics NGS）。
基因測(cè)序檢測(cè)范圍廣，效率高，在傳染病檢測(cè)中mNGS為主流技術(shù)。目前，基因測(cè)序平臺(tái)已經(jīng)出到了第三代，但是三代測(cè)序準(zhǔn)確率仍然不夠高，成本也較高昂，因此NGS仍然是主流。目前mNGS使用的技術(shù)中以羅氏公司的454技術(shù)、Illumina公司的Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為代表。
2、市場(chǎng)規(guī)模
mNGS市場(chǎng)規(guī)模大，行業(yè)仍處于發(fā)展期。據(jù)WHO對(duì)2015年全球死亡原因統(tǒng)計(jì)，全球因感染死亡的人數(shù)將近1000萬(wàn)，占全部死亡原因的17%。根據(jù)億歐網(wǎng)的數(shù)據(jù)，目前美國(guó)感染類(lèi)疾病的診斷市場(chǎng)總規(guī)模為180億美金，預(yù)計(jì)在2022年基于mNGS的感染類(lèi)疾病診斷市場(chǎng)將達(dá)到50億美元。根據(jù)IMS公司的數(shù)據(jù)，在我國(guó)感染性疾病的發(fā)病率為120-250人/10萬(wàn)人，微生物送檢量約5000萬(wàn)份，其中血培養(yǎng)約4000萬(wàn)例/年，肺泡灌洗液BALF約100萬(wàn)例/年，腦脊液及其他體液約50萬(wàn)例/年。另外，隨著腫瘤患者生存期顯著增長(zhǎng)，超過(guò)30%腫瘤患者死于復(fù)雜感染?；谝陨蠑?shù)據(jù)，當(dāng)檢測(cè)價(jià)格降至2000-2500元區(qū)間，目標(biāo)市場(chǎng)檢測(cè)量保守估計(jì)為500萬(wàn)份/年，約為100億人民幣。mNGS的高通量和廣覆蓋性使得其在混合感染和未知致病微生物的檢測(cè)方面具有巨大優(yōu)勢(shì)。2019年復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的胡必杰團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果顯示，mNGS具有更高的病原體鑒定靈敏度，受抗生素的影響較小，因此具有檢測(cè)傳染疾病的潛力及臨床意義。因此，可以預(yù)計(jì)mNGS擁有巨大的潛在市場(chǎng)。
3、競(jìng)爭(zhēng)格局
多家企業(yè)布局，行業(yè)發(fā)展態(tài)勢(shì)良好。mNGS在2014年第一次在臨床上成功應(yīng)用于病原體的診斷，行業(yè)發(fā)展歷史較短，但是mNGS已經(jīng)受到業(yè)內(nèi)關(guān)注，在各種展會(huì)和學(xué)術(shù)會(huì)議上都能看到mNGS的宣傳和討論，布局 mNGS的企業(yè)也日漸增多。國(guó)外代表公司有IDbyDNA、Karius，國(guó)內(nèi)公司有華大基因、博奧生物、達(dá)瑞生物、賽哲生物、微遠(yuǎn)基因、金域醫(yī)學(xué)、金匙基因等數(shù)十家企業(yè)，行業(yè)發(fā)展勢(shì)頭火熱。不過(guò)關(guān)于mNGS在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用，目前全球還沒(méi)有相關(guān)領(lǐng)域的注冊(cè)試劑獲批。國(guó)外是通過(guò)LDT的方式開(kāi)展,國(guó)內(nèi)目前處在方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證階段，由中檢院負(fù)責(zé)，華大基因、博奧生物、達(dá)瑞生物和賽哲生物四家公司是第一批參與標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證的公司。其中華大基因用自己的BGISEQ測(cè)序平臺(tái)，博奧生物、達(dá)瑞生物兩家用Thermo Fisher的NGS平臺(tái)，賽哲生物用的是Illumina平臺(tái)。
化學(xué)發(fā)光、PCR與mNGS在傳染病診斷領(lǐng)域相輔相成
1、化學(xué)發(fā)光
從便捷程度而言，化學(xué)發(fā)光相比分子診斷整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)更短，價(jià)格更低，并且化學(xué)發(fā)光儀器相比分子診斷儀器在醫(yī)院中的普及度更高。如目前醫(yī)院術(shù)前八項(xiàng)檢查較多的使用化學(xué)發(fā)光技術(shù)，其價(jià)格遠(yuǎn)低于使用分子診斷方法，靈敏度可達(dá)到要求，檢測(cè)得到結(jié)果的速度也更快。
從應(yīng)用范圍來(lái)講，由于化學(xué)發(fā)光應(yīng)用免疫診斷原理測(cè)血清樣本中的特異性抗原，其原理決定著化學(xué)發(fā)光無(wú)法被分子診斷替代：1）從取樣而言，化學(xué)發(fā)光取得是血清樣本可避免取其他樣本的操作不規(guī)范問(wèn)題。對(duì)于比如新冠病毒等下呼吸道感染疾病而言，化學(xué)發(fā)光可避免核酸檢測(cè)中由于取樣困難及不規(guī)范而導(dǎo)致的假陰性問(wèn)題。2）傳染病疫苗的抗體檢查，僅可使用免疫診斷的方法。如乙肝疫苗的有效期是五年。由于每個(gè)人的身體狀況不一樣會(huì)導(dǎo)致乙肝抗體存活時(shí)間不同，因此再次接種乙肝之前需做乙肝病毒抗體檢測(cè)，還可檢查抗體滴度，這時(shí)化學(xué)發(fā)光的診斷方法成為了最佳選擇。
然而化學(xué)發(fā)光基于免疫的原理也有一定的局限性：比如其要求被檢測(cè)的抗原或抗體具有特異性，而往往人體內(nèi)出現(xiàn)特異性抗體時(shí)，患者已經(jīng)患病較長(zhǎng)時(shí)間，傳染病患者可能在不知情時(shí)已經(jīng)完成疾病對(duì)于周?chē)巳旱膫鞑?，因此該診斷手段對(duì)于早期傳染病患者的確診可能無(wú)法起到太大作用，對(duì)于傳染病的早期發(fā)現(xiàn)和遏制作用也有限，往往更適用于已表現(xiàn)出明顯癥狀的患者的確診。
2、PCR
從便捷程度而言，PCR的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)（樣本采集、預(yù)處理、上機(jī)檢測(cè)、報(bào)告）過(guò)程介于化學(xué)發(fā)光和mNGS之間，價(jià)格也相比mNGS要低的多，靈敏度相比化學(xué)發(fā)光或較高。此外對(duì)于本身?yè)碛蠵CR實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)院，在二者皆可選的情況下，或更有動(dòng)力做PCR檢測(cè)而非將mNGS檢測(cè)外包。
從應(yīng)用范圍來(lái)講，PCR技術(shù)相比化學(xué)發(fā)光或擁有更多優(yōu)勢(shì)：1）分子診斷更適用于傳染病早期的大規(guī)模確診。理論上，只要樣本有一個(gè)病原體存在，PCR就可以檢測(cè)到。PCR對(duì)病原體的檢測(cè)解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問(wèn)題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。因此，考慮到傳染病防治的關(guān)鍵點(diǎn)之一在于早期對(duì)于疾病的迅速確診，PCR技術(shù)更適用于傳染病早期的大規(guī)模確診，可以克服免疫診斷的滯后性和基因測(cè)序的復(fù)雜性。在本次新型冠狀病毒肺炎疫情中，通過(guò)NMPA審批的試劑盒也以PCR試劑盒為主。2）分子診斷可對(duì)病毒分型。如目前HPV診斷主要應(yīng)用PCR技術(shù)，PCR可以鑒定特殊的HPV型別以及變異株，并對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性的處理，更有效預(yù)防宮頸癌。3）PCR可確定病毒載量。在抗病毒藥物治療監(jiān)測(cè)的過(guò)程中，病毒載量是判斷藥物療效的重要指標(biāo)。如HIV的藥物載量測(cè)定需通過(guò)PCR來(lái)測(cè)定血液中HIV RNA的量，通過(guò)藥物載量的高低變化可幫助判斷HIV藥物效果。
PCR有一定的局限性：將PCR技術(shù)運(yùn)用于傳染病的臨床檢測(cè)也容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題，原因就在于樣本可能受到污染或者檢測(cè)過(guò)程中操作不當(dāng)。因此，PCR診斷要求在高標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，以此提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3、mNGS
mNGS擁有具有無(wú)需預(yù)先培養(yǎng)樣本、靈敏度高、高通量等優(yōu)勢(shì)，未來(lái)發(fā)展前景非常廣闊。但與此同時(shí)，由于起步晚，目前有著價(jià)格貴、普及度低等問(wèn)題。
從應(yīng)用范圍來(lái)講，mNGS對(duì)新發(fā)的、疑難的感染病能夠指明方向：1）mNGS檢測(cè)覆蓋范圍廣。相較于病原學(xué)診斷與常規(guī)的培養(yǎng)，mNGS沒(méi)有偏移性，即不會(huì)由于標(biāo)本中存在多種病原體而導(dǎo)致病原學(xué)診斷的偏移性，檢測(cè)范圍覆蓋廣，可以同時(shí)培養(yǎng)多種病原體，效率高。因此mNGS在確診混合感染病人病原體和在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查中未能發(fā)現(xiàn)病原體的患者的治療上具有優(yōu)勢(shì)，不僅可以用于新型傳染病早期大規(guī)模爆發(fā)時(shí)迅速完成病原體基因測(cè)序，鑒定新的病毒株，促進(jìn)有效藥物和疫苗的探索和研發(fā)，也可用于早期低病毒含量樣本的檢測(cè)或?qū)崟r(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)可疑或灰區(qū)結(jié)果的確認(rèn)。2）mNGS可以彌補(bǔ)RT-PCR的缺點(diǎn)，并能監(jiān)測(cè)病毒傳播過(guò)程中可能的變異，同時(shí)對(duì)于部分病毒含量較低的樣本，mNGS可以提高檢測(cè)陽(yáng)性率。3）mNGS也可以在病原培養(yǎng)后做深度的二代測(cè)序，甚至全基因組分析，為預(yù)防以后同類(lèi)型傳染病的爆發(fā)積累經(jīng)驗(yàn)。
不過(guò)，mNGS技術(shù)目前有一定限制：在檢測(cè)過(guò)程中，樣本容易受到人源干擾，導(dǎo)致檢出率下降，而且mNGS的技術(shù)原理決定了它只能先測(cè)序后分析，所以上機(jī)測(cè)序這一步的時(shí)間開(kāi)銷(xiāo)始終無(wú)法跳過(guò)，導(dǎo)致該項(xiàng)技術(shù)的時(shí)效性打了折扣。
4多種手段互相補(bǔ)充，提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性
傳染病的檢測(cè)和治療往往不是一個(gè)短暫的過(guò)程。上述提到的檢測(cè)手段各有其優(yōu)缺點(diǎn)，目前尚未有一種檢測(cè)手段在成本、耗時(shí)、準(zhǔn)確度等方面都占據(jù)優(yōu)勢(shì)，它們的適用階段和范圍也各有不同。但是毫無(wú)疑問(wèn)，在整個(gè)傳染病檢測(cè)和防治的鏈條中，醫(yī)生可以根據(jù)實(shí)際需要來(lái)選取合適的檢測(cè)手段。如像本次傳播速度極快的新冠肺炎就可以通過(guò)PCR診斷來(lái)迅速確定患者，完成密切接觸者的隔離；但是PCR診斷假陽(yáng)性時(shí)有發(fā)生，為了提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，抗原和抗體檢測(cè)試劑隨后被研發(fā)出來(lái)，結(jié)合使用；NGS則被用來(lái)測(cè)定病毒基因序列，尋找有效藥物、進(jìn)行耐藥性分析和疫苗研發(fā)?？梢?jiàn)，傳染病的檢測(cè)和防治過(guò)程是緊密聯(lián)系的，為了保證執(zhí)行過(guò)程的高效性和準(zhǔn)確性，多種檢測(cè)手段的互相配合和補(bǔ)充是有必要的，或許未來(lái)隨著技術(shù)的發(fā)展，某種檢測(cè)手段可以取代其他手段，但是在近幾年內(nèi)，我們相信多種檢測(cè)手段仍會(huì)并存，互相配合。
來(lái)源：廣證恒生 作者：胡家嘉
編輯：As素 | 校對(duì)：Ryan | 責(zé)編：友凡
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